Bajo el gobierno de Hernandarias, llegan al Paraguay los jesuitas para contribuir a la tarea de pacificación de los indígenas, dando así origen a las célebres reducciones Jesuíticas. Desde 1604 a 1767 los jesuitas realizan con los indígenas guaraníes de Paraguay un original gobierno teocrático. Las reducciones jesuitas llegaron a constituir un estado prácticamente independiente, ya que tenían autonomía respecto a los gobernadores de Asunción. Las misiones llegaron a cobijar a más de un cuarto de millón de indígenas donde se les enseñaba la religión católica, agricultura, artesanía y pequeña industria.
La organización total abarcó 32 reducciones. Las misiones primero se instalaron en la región del Guairá (también llamado La Pinería)-actual estado brasileño de Paraná- y luego se establecieron entre los ríos Tebicuary y el divortium aquarum de la Cuenca del Plata con las cuencas menores afluentes directas del Océano Atlántico. La lengua guaraní fue respetada y se fijó en forma escrita; en ella fueron vertidas importantes obras de teología, impresos en la primera imprenta del Río de La Plata. Paralelamente el asunceno Ruy Díaz de Guzmán escribía las primeras obras de historia atinentes a la región del Cono Sur.
Respecto a la organización de las reducciones, cada pueblo estaba regido por el cura Rector, máxima autoridad; el cura doctrinero, encargado de la instrucción religiosa; el cura Despensero, encargado de la administración económica; y el cura auxiliar o coadjuntor, que era el nexo entre el rector y la población.
En 1617, durante el gobierno de Hernandarias (y a su pesar) se produjo la división de la Provincia en dos gobernaciones: la del Paraguay y la de Buenos Aires. De esta forma Paraguay perdió la zona marítima del estuario del Río de La Plata, y conservó solo Asunción, Ciudad Real y Villa Rica del Guayrá. La pérdida de la "salida de la tierra" por el puerto de Buenos Aires se hizo sentir mucho más desde que la provincia española del Paraguay perdió el estratégico territorio llamado la Yviazá (o La Vera), que correspondía al actual estado de Santa Catarina, territorio en el cual se hallaba el estratégico puerto (fundado en 1538) de San Francisco de Ybiaza.
En 1750, el tratado de límites entre España y Portugal, afectó a Paraguay con las pérdidas de Guayrá (entre el río Paraná y el Océano Atlántico, la gran provincia del Itatín y la región de Cuyabá que fueron cedidos al Brasil portugués a cambio de la Colonia del Sacramento, en la Banda Oriental del Río de la Plata.
En 1750, la corte española de acuerdo con la corona portuguesa decidieron repartirse el territorio de las reducciones, Los jesuitas se negaron a ello, dando lugar a que los ejércitos español y portugués emprendieran la llamada Guerra Guaranítica y acabaran con la resistencia en 1757.
En 1767 los jesuitas son expulsados de España y sus dominios por orden de Carlos III. Las reducciones pasaron a ser dirigidas por grupos seglares y religiosos, pero entraron en un proceso de decadencia.