De acuerdo a diversas investigaciones, se cree que en la cuenca de Santiago se establecieron los primeros grupos humanos cerca del 10.000 adC, los cuales eran principalmente nómadas cazadores-recolectores, que transitaban desde el litoral hacia el interior en búsqueda de guanacos durante la época de los deshielos cordilleranos.[7] Cerca del año 800, comenzaron a instalarse los primeros habitantes sedentarios debido a la formación de comunidades agrícolas junto al río Mapocho, principalmente de poroto, papa y maíz, y la domesticación de los auquénidos de la zona.
Las aldeas establecidas en la zona pertenecían a grupos picunches o promaucaes, sometidos al Imperio Inca desde fines del siglo XV y comienzos del siglo XVI. Los incas establecieron en el valle algunos mitimaes, siendo el principal uno instalado en el centro de la actual ciudad, fortalezas como el huaca de Chena y el santuario del cerro El Plomo.[7] La zona habría servido como base para las expediciones incásicas hacia el sur y como nudo vial del Camino del Inca.
Tras haber sido comisionado por Francisco Pizarro desde el Perú y hacer una larga travesía desde Cuzco, el conquistador extremeño Pedro de Valdivia llegó al valle del Mapocho, el 13 de diciembre de 1540. Las huestes de Valdivia acamparon junto a las aguas del río, en los faldeos del cerro Tupahue y comenzaron lentamente a entablar relaciones con los indios picunches que habitaban la zona, tras lo cual Valdivia convocó a los caciques de la zona a un parlamento donde les explicó su intención de fundar una ciudad en nombre del rey Carlos I de España, que sería la capital de su gobernación de Nueva Extremadura. Los indígenas habrían aceptado e incluso le habrían recomendado la fundación de la localidad en una pequeña isla ubicada entre dos brazos del río junto a un pequeño cerro llamado Huelén.[8]
El 12 de febrero de 1541, Valdivia fundaría oficialmente la ciudad de Santiago de Nueva Extremadura en honor al Apóstol Santiago, santo patrono de España, en las cercanías del Huelén, renombrado por el conquistador como "Santa Lucía". Siguiendo las normas coloniales, Valdivia encomendó el trazado de la nueva ciudad al alarife Pedro de Gamboa el cual diseñaría la ciudad en forma de damero. Al centro de la ciudad diseñó una Plaza Mayor, alrededor de la cual se destinaron solares para la Catedral, la cárcel y la casa del gobernador. En total se construyeron ocho cuadras de norte a sur y diez de oriente a poniente, y cada solar (un cuarto de cuadra) fue entregado a los colonizadores, que construyeron casas de barro y paja.
Valdivia partió meses después junto a sus soldados hacia el sur, dando inicio a la Guerra de Arauco. Santiago quedó desprotegida, lo que fue aprovechado por las huestes indígenas de Michimalonco que atacaron la incipiente urbe. El 11 de septiembre de 1541, la ciudad fue arrasada por los indígenas pero los 55 españoles lograron derrotar a los atacantes, debido a la resistencia liderada por Inés de Suárez, pareja de Valdivia. La ciudad sería reconstruida lentamente dando protagonismo a la recién fundada Concepción, donde se fundaría la Real Audiencia de Chile en 1565. Sin embargo, el constante peligro que afrontaba Concepción debido a su cercanía al conflicto bélico y una sucesión de desoladores terremotos, permitirían el establecimiento definitivo de la Real Audiencia en Santiago en 1607, reafirmando su rol de capital.